為指導(dǎo)各級(jí)疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開展新型冠狀病毒肺炎病例標(biāo)本采集與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，特制定本技術(shù)指南。

一、標(biāo)本采集

（一）采集對(duì)象。

新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例，需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料。

（二）標(biāo)本采集要求。

1.從事新型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。采樣人員個(gè)人防護(hù)裝備要求：N95及以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時(shí)更換外層乳膠手套。

2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院的醫(yī)護(hù)人員采集。

3.密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)刂付ǖ募部貦C(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。

4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。

（三）采集標(biāo)本種類。

每個(gè)病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本（包括上呼吸道標(biāo)本或下呼吸道標(biāo)本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本；根據(jù)臨床需要可留取便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清標(biāo)本和尿標(biāo)本。標(biāo)本種類：

1.上呼吸道標(biāo)本：包括鼻咽拭子、咽拭子等。

2.下呼吸道標(biāo)本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。

3.便標(biāo)本/肛拭子：留取糞便標(biāo)本約10克（花生大?。绻槐阌诹羧”銟?biāo)本，可采集肛拭子。

4.血液標(biāo)本：盡量釆集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血，采集量5ml，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。

5.血清標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。D一份血清應(yīng)盡早（Z好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，建議使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標(biāo)本主要用于抗體的測(cè)定，不進(jìn)行核酸檢測(cè)。

6.尿標(biāo)本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。

（四）標(biāo)本采集和處理。

1.鼻咽拭子：采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部，一手執(zhí)拭子，拭子貼鼻孔進(jìn)入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時(shí)，輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，應(yīng)停留片刻），然后緩緩取出拭子，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的病毒采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

2.咽拭子：被采集人員先用生理鹽水漱口，采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水中濕潤(rùn)（禁止將拭子放入病毒保存液中，避免抗生素引起過敏），被采集人員頭部微仰，嘴張大，并發(fā)“啊”音，露出兩側(cè)咽扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2～3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的病毒采集管中，尾部棄去，旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管中。

3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。

4.深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中。如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測(cè)前，加入2～3ml采樣液，或加入痰液等體積的痰液消化液。

使用時(shí)將儲(chǔ)存液用去離子水稀釋至50ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進(jìn)行使用，也可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。

5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次，也可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集。

6.肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支氣管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應(yīng)超過300ml。

7.糞便標(biāo)本：取1ml標(biāo)本處理液，挑取黃豆粒大小的便標(biāo)本加至管中，輕輕吹吸3-5次，室溫靜置10分鐘，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液進(jìn)行檢測(cè)。糞便標(biāo)本處理液可自行配制。

用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.5，以去離子水補(bǔ)充至1000ml，也可使用HANK’S液或其它等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液溶解便標(biāo)本制備便懸液。如患者出現(xiàn)腹瀉癥狀，則留取糞便標(biāo)本3～5ml，輕輕吹打混勻后，以8000rpm離心5分鐘，吸取上清液備用。

8.肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3～5cm，再輕輕旋轉(zhuǎn)拔出，立即放入含有3～5ml病毒保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，棄去尾部，旋緊管蓋。

9.血液標(biāo)本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml，根據(jù)所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進(jìn)行核酸提取。如需分離血漿，將全血1500～2000rpm離心10分鐘，收集上清于無菌螺口塑料管中。

10.血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。

其他材料：依據(jù)設(shè)計(jì)需求規(guī)范采集。

（五）標(biāo)本包裝。

標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。

1.所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。

2.將密閉后的標(biāo)本裝入密封袋，每袋限一份標(biāo)本。樣本包裝要求要符合《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

3.涉及外部標(biāo)本運(yùn)輸?shù)?，?yīng)根據(jù)標(biāo)本類型，按照A類或B類感染性物質(zhì)進(jìn)行三層包裝。

（六）標(biāo)本保存。

用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，可在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存;24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于一70℃或以下保存(如無一70℃保存條件，則于一20℃冰箱暫存)。血清標(biāo)本可在4℃存放3天，-20℃以下可長(zhǎng)期保存。應(yīng)設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存標(biāo)本。

(七)標(biāo)本送檢。

標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，如果需要長(zhǎng)途運(yùn)輸，建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。標(biāo)本運(yùn)送期問應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1上送標(biāo)本

各省(自治區(qū)、直轄市)5例及以上的聚集性病例，以及境外輸入病例的所有原始標(biāo)本上送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進(jìn)行檢測(cè)復(fù)核，并附樣本送檢單(見附表)。

2.標(biāo)本及毒株運(yùn)輸

2.1國(guó)內(nèi)運(yùn)輸

新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類屬于A類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的P1602分類包裝要求;環(huán)境樣本屬于B類，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN3373，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安

全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的P1650分類包裝要求;通過其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。

新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》(原衛(wèi)生部令第45號(hào))辦理《準(zhǔn)運(yùn)證書》。

2.2國(guó)際運(yùn)輸

在國(guó)際間運(yùn)輸?shù)男滦凸跔畈《緲?biāo)本或毒株，應(yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān)國(guó)家和國(guó)際相關(guān)要求。

2.3標(biāo)本和毒株管理

新型冠狀病毒標(biāo)本及毒株應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄毒株和樣本的來源、種類、數(shù)量，編號(hào)登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。

二、新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(一)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢瀏新型冠狀病毒核酸。

1.新型冠狀病毒核酸檢測(cè)

本指南中的核酸檢測(cè)方法主要針對(duì)新型冠狀病毒基因組中

開放讀碼框lab(openreadingframelab,ORFlab)和核殼蛋白(nucleocapsidprotein,N)。

靶標(biāo)一(ORFIab):

正向引物(F):CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物(R):ACGATTGTGCATCAGCTGA

熒光探針(P):

5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

靶標(biāo)二(N):

正向引物(F):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物(R):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

熒光探針(P):

5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATTTAMRA-3'

核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考相關(guān)廠家試劑盒說明。

2.結(jié)果判斷

陰性:無Ct值或Ct為400

陽(yáng)性:Ct值<37，可報(bào)告為陽(yáng)性。

灰區(qū):Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若重做結(jié)果Ct值<40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

注:如使用商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準(zhǔn)。

3病例確認(rèn)

實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè):

(1)同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)(ORFlab,N)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。如果出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，則需要重新采樣，重新檢測(cè)。如果仍然為單靶標(biāo)陽(yáng)性，判定為陽(yáng)性。

(2)兩種標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RTPCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性，或同種類型標(biāo)本兩次采樣檢測(cè)中均出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，可判定為陽(yáng)性。

核酸檢測(cè)結(jié)果陰性不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括:樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本;樣本收集的過早或過晚;沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本;技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

(二)血清抗體檢瀏。

血清抗體檢測(cè)(膠體金、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光、ELISA)用作新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陰性病例的補(bǔ)充檢測(cè)，在疑似病例診斷中與核酸檢測(cè)協(xié)同使用，或用于人群血清學(xué)調(diào)查和既往暴露調(diào)查。實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)陽(yáng)性病例需滿足以下兩個(gè)條件中的一個(gè):

1.血清新型冠狀病毒IgM和IgG抗體陽(yáng)性;

2.血清新型冠狀病毒IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高。

發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血用于IgM和IgG檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果陰性，建議發(fā)病后10天內(nèi)再次采集進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)病后3-4周恢復(fù)期血清用于IgG檢測(cè)。如果采用新冠快速檢測(cè)試劑盒，則以廠家說明書為準(zhǔn)。

三、實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)生物安全要求

根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)特點(diǎn)、流行病學(xué)特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理，具體要求如下:

(一)病毒培養(yǎng)。

病毒培養(yǎng)是指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗(yàn)、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實(shí)驗(yàn)等操作。上述操作應(yīng)當(dāng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室和防護(hù)條件下進(jìn)行，裂解劑或滅活劑加入后可比照未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的防護(hù)等級(jí)進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)活動(dòng)前，應(yīng)當(dāng)報(bào)經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動(dòng)的資質(zhì)。

(二)動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)是指以活病毒感染動(dòng)物、感染動(dòng)物取樣、感染性樣本處理和檢測(cè)、感染動(dòng)物特殊檢查、感染動(dòng)物排泄物處理等實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)操作。實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)活動(dòng)前，應(yīng)當(dāng)報(bào)經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生健康委批準(zhǔn)，取得開展相應(yīng)活動(dòng)的資質(zhì)。

(三)未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作。

未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作是指未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。

(四)滅活材料的操作。

感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測(cè)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、生化分析等操作應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作，可以在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。